Застосування реакцію Фогеса-Проскауэра для мікробіологічної диференціації ентеробактерій

У диференціальному визначення ентеробактерій і деяких вібріонів особливе місце займає реакція Фогеса-Проскауэра. Тест заснований на здатності бактерій ферментировать глюкозу з утворенням ацетоина.

Сутність процесу дослідження

У мікробіології реакція Фогеса-Проскауэра часто застосовується для диференціації всередині сімейства ентеробактерій іерсіній (в тому числі і збудників псевдотуберкульозу та ентероколітів), кишкових паличок, спороутворюючих аеробів. Результат візуалізується за рахунок колірного фарбування середовища при додаванні певних реагентів.

Даний тест відноситься до серії IMViC (абревіатура Indol, Methyl Red, Voges-Proskauer i Citrate) – групі ідентифікаційних тестів, що включають диференціальні визначення:

  • з индолом, заснованим на розщепленні триптофану в індол, використовується в присутності реагенту Ковача або Ерліха;
  • з застосуванням метилрота, або метилового червоного, виявляє заданий pH в результаті метаболизирования глюкози;
  • реакцію Фогеса-Проскауэра на виявлення ацетил-метилкарбинола;
  • утилізації цитрату з зміною кольору в результаті олужнення середовища.

Сутність процесу – візуалізація присутності діагностованих бактерій за рахунок взаємодії ацетоина, утвореного ними, з їдким калі в присутності кисню. Відбувається окислення ацетил-метилкарбинола до діацетилу, який утворює з’єднання яскраво-червоного або рожевого кольору. Підвищують чутливість тесту введенням альфа-нафтола до внесення їдкого калі.

Постановка тесту

Постановка реакції Фогеса-Проскауэра передбачає попереднє культивування мікроорганізмів. Чиста культура висівається на диференціально-діагностичне середовище Кларка, варіація якої – бульйон Кларка (без додавання агар-агару). Використовується або готова середовище, або приготована самостійно. Склад включає:

  • 5 г пептона;
  • 5 г глюкози;
  • 5 р двухосновного фосфату калію;
  • 1 л дистиляту.

В ході дослідження проводиться посів культури стерильною бактеріологічною петлею в рідку середу. Кількість – 5 мл у пробірці плюс контроль. Інкубація здійснюється при температурі 35-37 градусів протягом двох діб. Далі поетапно проводять дослідження реакцію Фогеса-Проскауэра:

  • 2,5 мл культури на бульйоні переносять у стерильну пробірку.
  • Вносять шість крапель альфа-нафтола (5%-ний спиртовий розчин).
  • Додають 40%-ний розчин їдкого калі в кількості 0,1 мл, або дві краплі.
  • Перемішування здійснюють обережним струшуванням пробірки.
  • Оцінюють результат через 15 хвилин від початку експерименту.
  • Дивіться також:  Спокусниця – це та, хто завжди знайде підхід

    Альтернативний метод проведення тесту – нічна інкубація, час якої скорочують до 18 годин до доби. Крім такого методу застосовують також експрес-тест: вносять петлею в 2 мл середовища культуру, інкубують близько чотирьох годин, далі додають реагенти в рівній кількості 2-3 крапель, перемішують і оцінюють результат за десять хвилин.

    Контролем виступає один із збудників пневмонії Klebsiella pneumoniae – штам atcc 13883.

    Оцінка результату

    Після закінчення необхідного часу після додавання реактивів (від 5 до 15 хвилин) повинна спостерігатися вишнево-червоне забарвлення при яскраво вираженій позитивній реакції, червона і рожева – при слабкою позитивною. Відсутність змін реєструють як негативний результат.

    Надлишок їдкого калі в розчині може давати імітацію позитивної реакції, забарвлюючи в мідний колір. В цьому випадку слід фіксувати негативний відповідь досліджуваної колонії. Також мідна фарбування з’являється у випадках, коли оцінка дається через годину після введення реагентів.

    При оцінці результату необхідно враховувати, що тривале культивування досліджуваних мікроорганізмів (понад три доби) веде до закислення середовища, що може призвести до некоректного результату дослідження. Реакція може бути слабо вираженою позитивною або ложноотрицательной.

    Вимоги до реагентів для тіста

    Реагенти для проведення реакції Фогеса-Проскауэра повинні відповідати вимогам, таким, як правильна концентрація, висока ступінь очищення і стабільність, яка досягається за допомогою дотримання правил зберігання.

    Готові набори для тіста містять, як правило, реагенти на 100 і більше застосувань і знаходяться в пластикових або затемнених скляних флаконах. Якість регулюється відповідною документацією.