Білок є важливим компонентом всіх організмів. Кожна його молекула складається з однієї або декількох поліпептидних ланцюгів, що складаються з амінокислот. Хоча інформація, необхідна для життя, кодується ДНК або РНК, рекомбінантні білки виконують широкий спектр біологічних функцій у організмах, включаючи ферментативний каталіз, захист, підтримку, рух і регулювання. За своїми функціями в організмі ці речовини можна розділити на різні категорії, такі як антитіла, ферменти, структурний компонент. Враховуючи важливі функції такі сполуки інтенсивно вивчалися і широко застосовувалися.
У минулому основним способом отримання рекомбінантного білка було його виділення з природного джерела, що, як правило, неефективно і займає багато часу. Недавні досягнення в галузі біологічних технологій молекул дозволили клонувати ДНК, що кодує певний набір речовин, вектор експресії речовин, таких як бактерії, дріжджі, клітини комах і клітини ссавців.
Простіше кажучи, рекомбінантні білки транслюються продуктами екзогенної ДНК в живих клітинах. Їх отримання зазвичай містить два основних етапи:
В даний час виробництво такої структури є одним з найпотужніших методів, використовуваних у медицині і біології. Склад має широке застосування в дослідженнях і біотехнології.
Медичний напрям
Рекомбінантні білки забезпечують важливі методи лікування різних захворювань, таких як діабет, рак, інфекційні захворювання, гемофілія та анемія. Звичайні склади таких речовин включають антитіла, гормони, інтерлейкіни, ферменти і антикоагулянти. Існує зростаюча потреба в рекомбінантних складах для терапевтичного застосування. Вони дозволяють розширити методики лікування.
рекомбінантні білки, отримані за допомогою генної інженерії, грають ключову роль на ринку терапевтичних ліків. В даний час найбільше терапевтичних речовин продукується в клітинах ссавців, оскільки їх суміші здатні виробляти високоякісні речовини, подібні до природних. Крім того, багато схвалені рекомбінантні терапевтичні білки виробляються в кишковій паличці завдяки хорошій генетиці, швидкому зростанню і высокопродуктивному виробництва. Це також несе позитивний ефект при розробці лікарських засобів на основі цієї речовини.
Проведення досліджень
Отримання рекомбінантних білків будується на різних методах. Речовини допомагають з’ясувати основні і фундаментальні принципи організму. Ці молекули можуть бути використані для ідентифікації і визначення місця розташування речовини, кодованого конкретним геном, і для розкриття функції інших генів у різних клітинних активностях, таких як передача сигналів клітинами, метаболізм, ріст, реплікація і загибель, транскрипція, трансляція і модифікація розглянутих у статті складів.
Таким чином, даний склад часто використовуються в молекулярної біології, клітинної біології, біохімії, структурних та біофізичних дослідженнях та багатьох інших галузях науки. При цьому отримання рекомбінантних білків має міжнародну практику.
Такі склади є корисними інструментами в розумінні міжклітинних взаємодій. Вони довели свою ефективність в декількох лабораторних методах, таких як ІФА та імуногістохімія (IHC). Рекомбінантні білки можуть бути використані для розробки ферментних аналізів. При використанні в поєднанні з парою відповідних антитіл клітини можуть застосовуватися в якості стандартів, для застосування нових технологій.
Біотехнології
Рекомбінантні білки, що містять аминокислотную послідовність, також використовуються в промисловості, виробництві продуктів харчування, сільському господарстві та біоінженерії. Наприклад, у тваринництві ферменти можуть додаватися в їжу, щоб підвищити поживну цінність кормових інгредієнтів, знизити витрати і відходи, підтримати здоров’я кишечника тварин, поліпшити продуктивність і поліпшити навколишнє середовище.
Крім того, молочнокислі бактерії (ЛАБ) довгий час використовувалися для виробництва ферментованих харчових продуктів, і нещодавно ЛАБ була розроблена для експресії рекомбінантних білків містять аминокислотную послідовність, які можуть знайти широке застосування, наприклад, для поліпшення травлення людини, тварин і харчування.
Однак такі речовини мають обмеження:
В цілому, досягнення у галузі біотехнології збільшили і сприяли виробництва рекомбінантних білків для різних застосувань. Хоча вони все ще мають деякі недоліки, речовини важливі в медицині, дослідженнях та біотехнології.
Зв’язок з хворобами
рекомбінантний білок шкоди для людини не несе ніякої. Це лише складова частина загальної молекули при розробці конкретного препарату або елемента живлення. Багато медичні дослідження показали, що примусова експресія білка FGFBP3 (скорочено BP3) в лабораторному штамі мишей з ожирінням показала значне зниження жирової маси, незважаючи на генетичну схильність до вживання.
Результати таких дослідів показують, що білок FGFBP3 може запропонувати нову терапію для усунення порушень, пов’язаних з метаболічним синдромом, таких як діабет 2 типу та ожиріння печінки. Але оскільки BP3 є природним білком, а не штучним лікарським засобом, клінічні випробування рекомбінантного людського BP3 можуть початися після заключного раунду доклінічних досліджень. На те є причини, пов’язані з безпекою проведення таких досліджень. Рекомбінантний білок шкоди для людини не несе і через його ступінчастою обробки і очищення. Зміни відбуваються і на молекулярному рівні.
PD-L2, один із ключових гравців у імунотерапії, який перебував у номінації Нобелівської премії по фізіології і медицині 2018 року. Ця робота, почата професором Джеймсом П. Аллисоном з США і професором Тасуку Хонджо з Японії, призвела до лікування раку, такого як меланома, рак легень та інші, на основі імунотерапії контрольної точки. Нещодавно AMSBIO додала у свою лінійку імунотерапії новий важливий продукт – активатор PD-L2 / TCR – СНТ Рекомбінантна клітинна лінія.
В експериментах з перевіркою концепції дослідники з Університету Алабами в Бірмінгемі під керівництвом доктора медичних наук Х. Лонг Чжена, професора Роберта Б. Адамса і директора відділу лабораторної медицини на кафедрі патології в школі UAB Медицини, висунули на перший план потенційну терапію рідкісного, але смертельного порушення згортання крові, TTP.
Результати цього дослідження вперше демонструють, що переливання тромбоцитів, навантажених rADAMTS13, може бути новим і потенційно ефективним терапевтичним підходом до тромбозу артерій, пов’язаній з вродженим і иммуноопосредованным TTP.
Рекомбінантний білок — це не тільки поживна речовина, але і лікарський засіб у складі розроблюваного препарату. Це лише деякі напрями, які зараз використовуються в медицині і відносяться до дослідження всіх його структурних елементів. Як показує міжнародна практика, структура речовини дає можливість на молекулярному рівні боротися з багатьма серйозними проблемами в організмі людини.
Розробка вакцин
Рекомбінантний білок — це певний набір молекул, які можна моделювати. Подібна властивість використовується і при розробці вакцин. Нова стратегія вакцинації, також відома як використання спеціальної рекомбінантної вірусної ін’єкції, може забезпечити захист мільйонів курчат, яким загрожує серйозне респіраторне захворювання, повідомили дослідники з Університету Единбурга та Інституту Пірбрайта. Ці вакцини використовують нешкідливі або слабкі версії вірусу або бактерії для введення мікробів в клітини організму. У цьому випадку експерти використовували рекомбінантні віруси з різними білками спайків в якості вакцин для створення двох версій нешкідливого вірусу. Існує багато різних лікарських препаратів побудованих на це зв’язку.
Рекомбінантний білок торговельні назви та аналоги має наступні:
В основному це протипухлинні препарати, але є й інші напрями в лікуванні, пов’язані з цим активною речовиною.
Згідно новому дослідженню, опублікованому в науковому журналі Nature Communications, нова вакцина, також звана LASSARAB, призначена для захисту людей від лихоманки Ласса, так і від сказу, показала багатообіцяючі результати в доклінічних дослідженнях. Кандидат на інактивовану рекомбинантную вакцину використовують ослаблений вірус сказу.
Дослідницька група вставила генетичний матеріал вірусу Ласса в вектор вірусу сказу, щоб вакцина экспрессировала поверхневі білки як у Ласса, так і клітин сказу. Ці поверхневі сполуки викликають імунну відповідь проти збудників інфекцій. Потім така вакцина була інактивована для «знищення» живого вірусу сказу, використаного для виготовлення носія.
Методи отримання
Є кілька систем виробництва речовини. Загальний метод одержання рекомбінантного білка будується на отриманні з синтезу біологічного матеріалу. Але є й інші способи.
В даний час існує п’ять основних систем експресії:
Останній варіант особливо підходить для експресії трансмембранных білків і токсичних сполук. В останні роки речовини, які важко експресувати звичайними внутрішньоклітинними способами, успішно інтегруються в клітинах in vitro. У Білорусі отримання рекомбінантних білків отримало широке застосування. Є ряд підприємств, що займаються цим питанням.
Бесклеточная система синтезу білка – це швидкий і ефективний метод синтезу речовин-мішеней шляхом додавання різних субстратів і енергетичних речовин, необхідних для транскрипції і трансляції у ферментній системі клітинних екстрактів. В останні роки поступово з’являються переваги бесклеточных методів таких типів речовин, як складні, токсичні мембранні, що демонструє їх потенційне застосування у біофармацевтичній області.
Бесклеточная технологія може легко і контрольовано додавати різноманітні не зустрічаються в природі амінокислоти для досягнення складних процесів модифікації, які важко вирішити після звичайної рекомбінантної експресії. Подібні методи мають високу цінність для застосування та потенціал для доставки ліків і розробки вакцин з використанням вирусоподобных частинок. Велика кількість мембранних білків було успішно экспрессировано у вільних клітинах.
Експресія складів
Рекомбінантний білок CFP10-ESAT 6 виробляється і застосовується для створення вакцин. Такий алерген туберкульозний дозволяє посилити імунітет і виробити антитіла. Загалом, молекулярні дослідження включають вивчення будь-якого аспекту білка, такого як структура, функція, модифікації, локалізація або взаємодії. Щоб дослідити, як конкретні речовини регулюють внутрішні процеси, дослідникам зазвичай потрібні кошти для виробництва функціональних сполук, що представляють інтерес та користь.
Враховуючи розмір і складність білків, хімічний синтез не є життєздатним варіантом для цього починання. Замість цього, живі клітини і їх клітинні механізми зазвичай використовуються як фабрики для створення і конструювання речовин на основі наданих генетичних шаблонів. Система експресії рекомбінантних білків надалі виробляє необхідну структуру для створення ліків. Далі відбувається відбір необхідного матеріалу для різної категорії препаратів.
На відміну від білків, ДНК легко конструювати синтетично або in vitro, використовуючи добре зарекомендували себе методи рекомбінантної. Отже, ДНК-матриці специфічних генів, з доданими репортерными послідовностями або послідовностями афінних міток або без них, можуть бути сконструйовані в якості матриць для експресії досліджуваного речовини. Такі склади, отримані з таких ДНК-матриць, і називаються рекомбінантними білками.
Традиційні стратегії експресії речовини включають трансфекцію клітин за допомогою ДНК-вектора, який містить матрицю, і подальше культивування клітин з тим, щоб вони транскрибували і транслювали бажаний білок. Зазвичай клітини потім лизируют для екстракції экспрессированного складу для подальшого очищення. Рекомбінантний білок CFP10-ESAT6 обробляється таким чином і проходить систему очищення від можливого утворення токсинів. Тільки після цього він надходить для синтезування в вакцину.
Як прокариотические, так і эукариотические in vivo системи експресії молекулярних речовин широко використовуються. Вибір системи залежить від типу білка, вимог до функціональної активності і бажаного виходу. Ці системи експресії включають ссавців, комах, дріжджів, бактерій, водоростей і клітин. У кожної системи є свої переваги і проблеми, і вибір правильної системи для конкретного застосування важливий для успішної експресії досліджуваного в статті речовини.
Експресія із ссавців
Застосування рекомбінантних білків дозволяє розробляти вакцини і ліки різного рівня. Для цього може використовуватися цей метод отримання речовини. Системи експресії ссавців можуть бути використані для продукування білків з тваринного світу, які мають найбільш нативну структуру і активність завдяки своїй фізіологічно релевантної середовищі. Це призводить до високих рівнів посттрансляційної обробки і функціональної активності. Системи експресії ссавців можуть використовуватися для виробництва антитіл, складних білків і сполук для використання у функціональних аналізах на основі клітин. Тим не менше, ці переваги в поєднанні з більш жорсткими умовами культури.
Системи експресії ссавців можна використовувати для отримання білків тимчасово або через стабільні клітинні лінії, де конструкція експресії інтегрована в геном господаря. У той час як такі системи можуть використовуватися в декількох експериментах, тимчасова продукція може генерувати велику кількість речовини за один-два тижні. Біотехнологія рекомбінантних білків такого типу користується високим попитом.
Ці скороминущі, високопродуктивні системи експресії ссавців використовують суспензійні культури і можуть давати вихід грам на літр. Крім того, ці білки мають більше нативного фолдинга і посттрансляційних модифікацій, таких як глікозилювання, порівняно з іншими системами експресії.
Експресія з комахи
Методи отримання рекомбінантного білка не обмежуються тільки ссавцями. Є і більш продуктивні способи в плані вартості виробництва, хоч і виходу речовини на 1 літр оброблюваної рідини значно нижче.
Клітини комах можна використовувати для експресії білка високого рівня з модифікаціями, подібними систем ссавців. Існує кілька систем, які можна використовувати для отримання рекомбінантного бакуловируса, який потім можна застосовувати для вилучення, представляє інтерес речовини в клітинах комах.
Експресії рекомбінантних білків можуть бути легко розширені і адаптовані до суспензионной культурі високої щільності для великомасштабного отримання з’єднання молекул. Вони більш функціонально схожі на нативний складу речовини ссавців. Хоча вихід може становити до 500 мг / л, виробництво рекомбінантного бакуловируса може займати багато часу і умови культивування більш складні, ніж прокариотические системи. Однак у більш південних і теплих країнах подібний метод вважається більш ефективним.
Бактеріальна експресія
Виробництво рекомбінантних білків може бути налагоджено і за допомогою бактерій. Ця технологія набагато відрізняється від описаних вище. Системи експресії бактеріального білка популярні, тому що бактерії легко культивуються, швидко ростуть і дають високі виходи рекомбінантного складу. Тим не менш, мультідоменні эукариотические речовини, экспрессируемые у бактеріях, часто є нефункциональными, тому що клітини не обладнані для виконання необхідних посттрансляційних модифікацій або молекулярного згортання.
Крім того, багато білки стають нерозчинними у вигляді молекул включення, які дуже важко відновити без жорстких денатураторов і наступних громіздких процедур рефолдинга молекулярного складу. Такий метод здебільшого вважається ще багато в чому експериментальним.
Бесклеточная експресія
Рекомбінантний білок містить аминокислотную послідовність стафилокиназы виходить дещо іншим шляхом. Він входить до складу багатьох видів ін’єкцій, від чого потрібно кілька систем перед використанням.
Бесклеточная експресія білка представляє собою синтез речовини in vitro з використанням сумісних з трансляцією екстрактів цілих клітин. В принципі, цілі клітинні екстракти містять макромолекули та компоненти, необхідні для транскрипції, трансляції і навіть посттрансляційної модифікації.
Ці компоненти включають РНК-полімеразу, регуляторні білкові чинники, форми транскрипції, рибосоми і тРНК. При додаванні кофакторів, нуклеотидів та специфічної матриці генів ці екстракти можуть синтезувати представляють інтерес білки за кілька годин.
Хоча вони не є стійкими для великомасштабного виробництва, безклітинні системи або системи експресії білка in vitro (IVT) мають ряд переваг в порівнянні з традиційними системами in vivo.
Бесклеточная експресія дозволяє швидко синтезувати рекомбінантні склади без задіяння клітинної культури. Безклітинні системи дозволяють мітити білки модифікованими амінокислотами, а також експресувати склади, які піддаються швидкої протеолітичної деградації внутрішньоклітинними протеазами. Крім того, за допомогою безклітинного методу простіше одночасно експресувати багато різних білків (наприклад, тестувати мутації білка шляхом експресії в невеликому масштабі з безлічі різних матриць рекомбінантних ДНК). У цьому репрезентативному експерименті для експресії білка каспази-3 людини використовували систему IVT.
Висновки і перспективи на майбутнє
Виробництво рекомбінантного білка тепер можна розглядати як зрілу дисципліну. Це результат численних поступових поліпшень в очищенні і аналізі. В даний час програми по відкриттю ліків рідко зупиняються через неможливість продукувати цільовий білок. Паралельні процеси для експресії, очищення та аналізу декількох рекомбінантних речовин в даний час добре відомі у багатьох лабораторіях по всьому світу.
Білкові комплекси і зростаючий успіх у створенні солюбилизированных мембранних структур зажадають більшої кількості змін, щоб йти в ногу з попитом. Поява ефективних контрактних дослідницьких організацій для більш регулярного постачання білками дозволить перерозподілити ресурси науки для вирішення цих нових завдань.
Додатково, паралельні робочі процеси повинні дозволяти створювати повні бібліотеки досліджуваного речовини, щоб забезпечити можливість ідентифікації нових цілей і розширеного скринінгу, поряд з традиційними проектами по виявленню ліків на основі малих молекул.
